可調(diào)焦距的透鏡可加速和增強(qiáng)多種現(xiàn)代顯微鏡方法（包括共聚焦、雙光子和光片顯微鏡）的三維成像能力。

顯微鏡初學(xué)者可能會感到困惑，因?yàn)樗麄冏⒁獾綐颖局袃H略微失焦的部分在圖像中看起來往往要模糊得多。人眼看到的景深似乎比相機(jī)看到的景深大得多。這種令人困惑的效果之所以發(fā)生，是因?yàn)檠劬m應(yīng)：通過顯微鏡觀察時(shí)，用戶會不斷（通常是無意識地）移動焦平面，而無需觸摸調(diào)焦旋鈕，只需將目鏡調(diào)整到不同的焦距即可。因此，自從顯微鏡發(fā)明以來，可調(diào)透鏡就幫助研究人員更直觀地感受到微觀物體的三維形狀和紋理。在具有電子圖像采集功能的現(xiàn)代顯微鏡中實(shí)現(xiàn)類似的裝置是非?？扇〉摹Ｈ缃?，科學(xué)家越來越需要在越來越短的時(shí)間尺度上以高空間分辨率對生物體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行成像?，F(xiàn)代生物顯微鏡也正慢慢從對載玻片和蓋玻片之間的扁平小樣本進(jìn)行成像轉(zhuǎn)向 3D 細(xì)胞培養(yǎng)、整個(gè)胚胎甚至動物體內(nèi)成像，以研究更自然的環(huán)境中的發(fā)展和生理學(xué)。

傳統(tǒng)上，獲取 3D 圖像數(shù)據(jù)需要使用載物臺或壓電物鏡 Z 掃描儀對物鏡或樣本進(jìn)行機(jī)械平移。由于此類設(shè)備中活動部件的機(jī)械慣性，要實(shí)現(xiàn)數(shù)百微米 Z 范圍 10 到 20 Hz 以上的體積掃描速率非常具有挑戰(zhàn)性。

另一種稱為“遠(yuǎn)程聚焦”的解決方案涉及改變光進(jìn)入或離開顯微鏡物鏡時(shí)的會聚度，以分別引起激發(fā)或發(fā)射焦點(diǎn)的軸向偏移。所有類型的可調(diào)光學(xué)元件都可以用于此目的：例如空間光調(diào)制器、可變形鏡和可調(diào)焦距透鏡?？烧{(diào)焦距透鏡成本低、結(jié)構(gòu)和控制簡單、焦距調(diào)節(jié)范圍廣，特別適合要求以中等分辨率進(jìn)行快速體積采樣的顯微鏡應(yīng)用。

可調(diào)焦距透鏡技術(shù)

Optotune 的可變焦透鏡采用彈性聚合物材料。透鏡的核心元件由一個(gè)薄膜組成，該薄膜在充滿液體的腔室和空氣之間建立界面（圖 1）。為了調(diào)整焦距，音圈致動器對圍繞透鏡通光孔徑的液體容器施加壓力。因此，液體被迫進(jìn)入透鏡的中心，從而改變膜的曲率。控制電可調(diào)透鏡 (ETL) 很簡單，只需要一個(gè)現(xiàn)成的電流控制器或透鏡驅(qū)動器為透鏡提供 0 至 290 mA 之間的電流。

圖 1. ( a、b )：電動可調(diào)鏡頭 (ETL) 的工作原理。電流控制的電磁或機(jī)械致動器向下推充滿液體的鏡頭容器，迫使鏡頭液體進(jìn)入鏡頭中心并改變其形狀。( c ) 對于 ETL，我們提供了一個(gè)軟件控制的鏡頭驅(qū)動器 ( d )，用于提供電流。( e ) ETL 的典型響應(yīng)時(shí)間約為 5 毫秒。實(shí)際穩(wěn)定時(shí)間隨鏡頭光圈而變化。

有各種各樣的 ETL 可供選擇，其光圈范圍從 6mm到 16mm。對于高色散鏡頭液體版本，典型的焦距范圍為 52 至 120 mm，而對于低色散鏡頭液體版本，典型的焦距范圍為 80 至 200mm。在工作過程中，控制電流會使鏡頭升溫，導(dǎo)致溫度相關(guān)的焦點(diǎn)漂移。由于液體鏡頭的熱焦距膨脹比玻璃鏡頭的熱焦距膨脹大約大兩個(gè)數(shù)量級，因此鏡頭需要集成溫度傳感器。結(jié)合靠近液體的溫度傳感器以及鏡頭上校準(zhǔn)曲線的存儲，USB 驅(qū)動程序固件可以計(jì)算出正確的電流值，以設(shè)置和維持鏡頭在給定的焦距。ETL的一大優(yōu)勢是響應(yīng)時(shí)間短，只有幾毫秒。圖 1e 顯示了響應(yīng)矩形階躍脈沖時(shí)歸一化屈光度隨時(shí)間變化的典型示例。可調(diào)透鏡在 240 至 2500 nm 范圍內(nèi)具有較大的透射率和較高的損傷閾值（1064 nm 連續(xù)波操作下的損傷閾值為 10 kW/cm2），并且具有保偏功能。

將可調(diào)透鏡集成到顯微鏡中

現(xiàn)代顯微鏡使用無限遠(yuǎn)校正物鏡，這意味著源自樣品的光會以平行光束的形式從物鏡中射出。要?jiǎng)?chuàng)建圖像，需要一個(gè)額外的筒鏡（圖 2）。相反，通過將準(zhǔn)直激光束發(fā)送到物鏡中，激光會集中到樣品內(nèi)部的焦點(diǎn)上。使用可調(diào)透鏡改變光束的準(zhǔn)直狀態(tài)會移動焦平面。例如，當(dāng)將發(fā)散光束發(fā)送到物鏡時(shí)，焦點(diǎn)會移離其前透鏡。

圖 2. ( a ) 在具有無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)的顯微鏡中，圖像由物鏡和筒鏡形成。( b ) 通過在物鏡和筒鏡之間插入由兩個(gè)消色差透鏡組成的附加中繼系統(tǒng)，形成共軛光瞳。ETL 和偏置透鏡可以放置在此位置以進(jìn)行軸向聚焦，而無需改變數(shù)值孔徑或放大倍數(shù)。水平放置 ETL 和偏置透鏡可避免重力引起的透鏡膜變形。

對于大多數(shù) 3D 顯微鏡應(yīng)用，需要能夠增加和減少物鏡的工作距離。一些 ETL 僅限于在正焦距極限之間進(jìn)行調(diào)整。在這種情況下，需要將它們與固定負(fù)偏移透鏡 (OL) 配對，以將光束從會聚變?yōu)榘l(fā)散。當(dāng)通過顯微鏡的目鏡觀察時(shí)，人類觀察者會移動頭部，直到他們的眼睛位于顯微鏡的出瞳處，通?？梢姙樗坪鯌彝Ｔ谀跨R上方的小亮盤。當(dāng)放置在出瞳處時(shí)，眼睛可以最好地概覽微觀圖像，并且作為“集成”的人類聚焦裝置發(fā)揮最佳作用。理想情況下，ETL/OL 組合也放置在這樣的瞳孔位置，但使用標(biāo)準(zhǔn)目鏡的出瞳通常沒有好處：典型的筒透鏡和目鏡組合的高中置放大倍數(shù)極大地限制了可用的聚焦范圍。這是因?yàn)檎{(diào)整范圍與顯微鏡放大倍數(shù)的平方成反比。更好的選擇是使用定制的中繼系統(tǒng)創(chuàng)建與顯微鏡物鏡共軛的瞳孔位置（圖 2）。需要小心地將 ETL/OL 組件放置在光路的垂直部分（圖 2b）。否則，由于重力引起的透鏡膜變形，圖像可能會出現(xiàn)不必要的像差（尤其是彗形像差）。在具有高度模塊化設(shè)計(jì)的新一代研究顯微鏡中，集成這種中繼系統(tǒng)通常很簡單。盡管如此，一些商用儀器不應(yīng)該由用戶進(jìn)行大量修改。在這種情況下，ETL/OL 組合可以放置在平行光束路徑上的其他位置。缺點(diǎn)是將可調(diào)元件放置在遠(yuǎn)離共軛瞳孔的位置會導(dǎo)致聚焦時(shí)放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑 (NA) 發(fā)生變化。用光學(xué)設(shè)計(jì)術(shù)語來說，該系統(tǒng)不再是遠(yuǎn)心的。因此，焦距偏移伴隨著變焦效果和分辨率變化。對于小的調(diào)諧范圍 - 幾十分之一微米 - 這些影響通常非常小且可以容忍。對于較大的焦點(diǎn)位移，可以通過圖像處理來補(bǔ)償放大倍數(shù)的變化。

圖 3.使用 40 倍物鏡和集成在轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡中的 ETL 拍攝的花粉粒（直徑 100 μm）的 Z 軸堆疊圖。圖中顯示了不同軸向焦點(diǎn)位置的單幀圖像和最大強(qiáng)度投影。最大 Z 軸范圍為 60μm。

在遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中，成本和復(fù)雜性之間存在著重要的權(quán)衡。與可變形鏡或空間光調(diào)制器不同，大多數(shù)可調(diào)透鏡只有一個(gè)自由度，即焦距。在遠(yuǎn)程聚焦路徑中配備單個(gè) ETL 的顯微鏡無法像真正的自適應(yīng)光學(xué)顯微鏡那樣在 Z 調(diào)諧范圍內(nèi)執(zhí)行同樣復(fù)雜的像差校正。但是，使用 ETL 聚焦的成本僅為成熟自適應(yīng)光學(xué)裝置成本的一小部分。

應(yīng)用示例：共聚焦顯微鏡

共聚焦顯微鏡是最重要的顯微鏡技術(shù)之一，它在細(xì)胞生物學(xué)、單分子物理學(xué)和許多其他學(xué)科中有著廣泛的應(yīng)用。我們測試了 ETL 與連接到倒置顯微鏡支架（Olympus IX71）的商用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡模塊（Yokogawa CSU-X1）的組合。

由于無法在該顯微鏡中集成中繼系統(tǒng)，因此將 ETL/OL 組件安裝在可旋轉(zhuǎn)到光路中的定制濾光塊中。使用 40 倍物鏡和 1.3 NA（Olympus UPLFLN 40XO），最大 Z 范圍達(dá)到 60 μm。

應(yīng)用示例：體內(nèi)雙光子顯微鏡

由于在散射介質(zhì)中具有出色的成像能力，雙光子激發(fā)是一種非常適合對腦組織深處進(jìn)行熒光成像的技術(shù)。結(jié)合神經(jīng)元活動的功能指標(biāo)和體內(nèi)成像協(xié)議，雙光子顯微鏡是一種標(biāo)準(zhǔn)方法，用于記錄活體小鼠腦內(nèi)數(shù)百微米深處的十分之一到數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的群體活動。

對單個(gè)焦平面的采樣只能提供局部網(wǎng)絡(luò)中分布活動模式的一瞥。因此，我們修改了現(xiàn)有的雙光子顯微鏡，該顯微鏡能夠使用帶有 ETL 和 OL 的聲光偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行非?？焖俚?X/Y 掃描。1聲光偏轉(zhuǎn)器可以以千赫茲的速率以隨機(jī)訪問模式快速將飛秒激光束瞄準(zhǔn)大量神經(jīng)元。

添加 ETL 可以快速瞄準(zhǔn)多個(gè)焦平面。我們實(shí)現(xiàn)了 30 到 40 Hz 的成像速率，最多可對 40 個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像，這些神經(jīng)元分布在相距 30 到 100 μm 的兩個(gè)平面上（圖 4）。除了多平面成像外，ETL 還可用于對清醒和行為動物進(jìn)行運(yùn)動校正。

圖 4. ( a ) 物鏡支架，用于將 ETL 集成到帶有聲光偏轉(zhuǎn)器的定制雙光子顯微鏡中，以便對小鼠大腦中的神經(jīng)元活動進(jìn)行體內(nèi)成像。ETL 由電流控制器 (CC) 驅(qū)動，并與偏置透鏡（未顯示）組合安裝在靠近物鏡的位置。( b ) 由于 ETL 未放置在共軛瞳孔位置，因此掃描體積呈錐形。聲光偏轉(zhuǎn)顯微鏡可以使用鈣指示劑以隨機(jī)訪問掃描模式快速測量神經(jīng)元活動。ETL 增加了以高達(dá) 40 Hz 的速率對多個(gè)平面進(jìn)行成像的能力。( c ) 這些圖像顯示了不同深度的兩個(gè)平面（神經(jīng)元顯示為灰色，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示為橙色）。選擇用于快速鈣成像的細(xì)胞（1 到 40）已標(biāo)記。神經(jīng)元信號表現(xiàn)出對施加在動物胡須上的重復(fù)氣流的刺激鎖定反應(yīng)。比例尺：20 μm。

應(yīng)用示例：快速3D光片顯微鏡

在過去十年中，光片顯微鏡和選擇性平面照明顯微鏡 (SPIM) 已被公認(rèn)為生物樣本體內(nèi)成像的理想工具（例如，用于記錄斑馬魚和果蠅的胚胎發(fā)育）。在 SPIM 中，樣品從側(cè)面用光片照射，以將熒光激發(fā)限制在顯微鏡物鏡焦點(diǎn)的單個(gè)平面上。SPIM 提供出色的光學(xué)切片、低光毒性和高圖像采集速度，并被《自然方法》評為 2014年度方法。

圖 5.使用配備 ETL 的快速 Z 掃描 (ETL-SPIM) 光片顯微鏡以 60 Hz 體積速率對跳動的斑馬魚心臟進(jìn)行 3D 重建。心臟標(biāo)記為藍(lán)色；紅細(xì)胞顯示為紅色。

最近，SPIM 裝置配備了 ETL，可進(jìn)行快速體積掃描。使用以每秒數(shù)百到數(shù)千幀的速度運(yùn)行的相機(jī)，可以以每秒 30 到 60 次體積掃描的空前速度獲取跳動斑馬魚心臟內(nèi)的 10 到 20 個(gè)平面。4如此高的體積率可以追蹤流經(jīng)跳動心臟的單個(gè)紅細(xì)胞。

未來

未來，將提供具有更大通光孔徑和調(diào)諧范圍的 ETL，以及可使重復(fù)性提高一個(gè)數(shù)量級的創(chuàng)新驅(qū)動電子設(shè)備。還可以想象，帶有集成可調(diào)鏡頭的顯微鏡物鏡將在未來十年內(nèi)投入常規(guī)使用。

認(rèn)識作者

Fabian F. Voigt 是瑞士蘇黎世大學(xué)腦研究所的博士生

致謝

作者感謝 Manuel Aschwanden、Jerry Chen、Adriana Dabacan、Helge Ewers、Florian Fahrbach、Benjamin Grewe、Fritjof Helmchen、Jan Huisken、Michaela Mickoleit、Oliver Pf?ffli 和 Mark Ventura 為實(shí)現(xiàn)基于 ETL 的快速 3-D 顯微鏡所做的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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